In der RFB werden etwa 60.000 Bücher aufbewahrt, deren Eigentümerin die Stiftung Luthergedenkstätten in Sachsen-Anhalt (SLG) ist. Davon hat der Altbestand eine Größe von ca. 27.000 Bänden. Zum Altbestand werden Drucke gezählt, die vom Beginn des Buchdrucks bis zum Erscheinungsjahr 1800 reichen. Die übrigen 33.000 Bände sind Bücher, die ab 1801 erschienen sind. Dieser Bereich wird ständig erweitert und erwirbt umfassend die aktuelle Forschungsliteratur. Diese Sekundärliteratur wird in erster Linie angeschafft, um den historischen Altbestand zu erschließen und die reformationsgeschichtliche Forschung zu unterstützen.
Der Altbestand repräsentiert vor allem die Geschichte und die Wirkungen der Reformation. Im Mittelpunkt steht dabei das Leben und Werk Martin Luthers. Sein Schaffen wird umfassend dokumentiert, das seiner Zeitzeugen in Auswahl. Daneben gibt es spezielle Sammlungsbereiche, wie z. B. den Bestand an Inkunabeln, Bibeldrucken, Gesangbücher.
Der Bestand setzt sich aus verschiedenen Sammlungen zusammen, die auf verschiedenste Weise ihren Weg in die Bibliothek fanden. Es handelt sich dabei um die Sammlung Augustin, Sammlung Knaake, Bibliothek der Königlichen Regierung zu Merseburg, Sammlung Kawerau, Fürstliche Bibliothek Stolberg-Wernigerode, Sammlung Ficker, Dissertationssammlung und Neuerwerbungen. Des weiteren gibt es die Sammlung C. G. Holtzhausen. Diese Sammlung ist allerdings nicht im Schloss aufgestellt sondern befindet sich auf Grund der im Schenkungsvertrag von Carl-Gustav Holtzhausen getroffenen Regelungen im Lutherhaus. Die Bände sind vollständig katalogisiert und über den Opac der Reformationsgeschichtlichen Forschungsbibliothek recherchierbar. Sie ist nach vorheriger Absprache im Lutherhaus benutzbar.